אולם בארמון הקודש. לדבריו יש בעיר מהומות. מישהו שאינו מוכר אליו בראש ההמון - חוטפים, רעולי פנים, רקדנים עם פעמונים, אנשים עם מכסה מנוע שחור - איים, ניבא והפציר בעם שלא לציית למלכה. השופט של המלכה ריצ'יו מאשר שהוא צופה מדי פעם בזמן שאנשים מאזינים בשקיקה לדרשות אלה. עוד מספר בדף כי האנשים התפרצו לקפלה של המלכה וצעקו: "קן הפפיסטים!", שזירתו של דארנלי, בעלה של המלכה, קפץ אל המזבח והחל להעמיד פנים שהוא דרשה, והאנשים ענו לו בזיווגים לעגים. המלכה מרי סטיוארט בייאוש. היא חשה בשנאת האנשים: רוב אנשי החצר עזבו אותה; היא תוהה כיצד הנצרות שלה יכולה להיות שונה כל כך מהנצרות של תושבי סקוטלנד. ריצ'יו מציע להכין באופן מיידי צו שמעניש את האחראים למהומות. מריה מכתיבה את העמוד שלו, העמוד מבהיר אם להזין את שמו של היינריך דרנלי, בעלה של המלכה. מרי מהססת; היא חושדת שהמהומות נוצרו בהשראתו - אחרי הכל, ההמון הובל על ידי מזנון המלך. כאן מזכיר לה ריצ'יו שהיא המלכה; היא כמו השמש, ויש לה את הזכות להעניש מה '. הוא דורש להתקשר מייד לקצין התורן להודיע על צו המלכה. דגלאס נכנס. מריה אומרת לו לקחת את העיתון לקנצלר המלכותי מורטון, כדי שיחתום. דגלאס סורק את הצו ורואה שאין לו את שמו של המלך. הוא שואל את המלכה על כך. ריצ'יו אחראי עליה. דגלאס מאבד את העשתונות. הוא קורא למלכה שלא להשתמש באמצעי דיכוי עקובים מדם, ורמז שהוא רואה בכך השפעה צרפתית או איטלקית. אבל המלכה מזכירה לו בקור רוח את כוחה לחסל את הנושאים שאינם צייתנים לרצונה. מריבה מתפרצת בין ריצ'יו לדאגלס, דגלאס מאתגר את ריצ'יו לדו קרב ונשבע שהוא יהרוג את הוונציאני מחר. המלכה עוזבת ולוקחת את ריצ'יו משם. דגלאס נותר לבד, הוא שוקל דו קרב. מורטון נכנס. דגלאס מראה לו את הצו. מורטון הוא החלטי: הוא חושש מזעמם של המלך והמלכה כאחד. מבלי להחתים, מורטון מציע את המלך. בשעה זו, הנרי היה מעורב בשיחה עם הליצן שלו ניק, המתגרה בו בעובדה שלמלכה יש כוח אמיתי בסקוטלנד, והנרי הוא רק בעלה, שהמלכה בוחרת באלה קרובים, למשל, הנבל האיטלקי ריצ'יו ... בזמן הזה, מורטון מביא צו מצער. מלך בכעס הוא מחליט להרוג את ריצ'יו. המלך לינדזי נכנס לבית המשפט, הוא קורא למלך לצוד עם הבז החדש שנרכש. מורטון עונה כי למלך יש כבר היום כיבוש. לינדזי מצטרף ברצון לעלילה נגד ריצ'יו. פשוטו כמשמעו הוא אוסר להרוג את ריצ'יו הלילה, כי עליו להרוג אותו מחר בבוקר. ואז הנרי, המנצל את העיכוב, שולח את האסטר לאסטרולוג כדי לגלות מה מיקום הכוכבים לכוונותיו.
האסטרולוג במעבדה שלו (הוא גם אלכימאי) טוען עם עצמו שהניסיון מאשר את חוסר התוחלת של המדע, המטרה הזו, רצון הכוכבים שולט באדם, נפטר מטוב ורע. ניק נכנס ומפזרים בוורציות, האסטרולוג אינו נחות ממנו בשנינות. ניק מדווח כי המלך שלח אותו לשאול על גורלו של ריצ'יו ואומר לאסטרולוג לחזות את מותו של ריצ'יו. האסטרולוג עונה שהכוכבים יגידו לו, לא אנשים, ובתורו מנבא את מותו של הכומר. עם זה הוא עוזב. מופיע עמוד המלכה שנגרם על ידי האסטרולוג. פייג 'אוהב את פילגשו. האסטרולוג אומר לו לומר למלכה שהיום הגבר שהיא אוהבת ימות. "איך, בוטוול ימות היום?" - קורא דף. האסטרולוג תמה. חשב לריקיו והוא ממהר לעמוד ולהזהיר אותו בעניין זה. אם נותר לבדו תוהה האסטרולוג - נראה גם מהכוכבים שבוטוול היה איכשהו קשור באפלות עם המלכה - דרך מאדים, שבתאי ... בוטוול נכנס. מהמונולוג שלו מתברר שהוא מצא את עצמו באופן בלתי צפוי בביתו של אסטרולוג. בהבנה לאן הגיע, בוטוול שואל את האסטרולוג כמה נותר לו לחיות. הזקן עונה ששלוש שנים ושבוטוול יהיה מלך. הבוטוול מוציא בקבוק רעל איתו רצה להתאבד, רוצה לזרוק אותו - ומהסס. ואכן, באווירת תככים בארמון, כל כלי נשק יועיל. הוא עוזב.
בדף אומרים למלכה כי ריצ'יו יבוא בקרוב. המלכה מצפה אליו - לדעתה הוא לבדו נשאר נאמן לה. "ובוטוול?" - שואל את הדף. "מי זה Botvel?" - המלכה מעוניינת. עמוד מופתע מספר למרי כיצד, תוך כדי שייט, רוח חזקה שלפה ורד מראשה של המלכה, פרח נפל למים. ואז אחד מאנשי החצר - בוטוול - מיהר לסירה ורדף בפחד אחר החתירה לתפוס ורד מהמים. לאחר ששמעה את הסיפור, מרי שולחת דף להתפלל. היא מתוודה בפני האל כי אין לה יותר כוח להתנגד לאהבתה לבוטוול. המלכה יודעת שבבית המשפט היא נחשבת מאוהבת בריצ'יו. ריצ'יו נכנס. מרי מדווחת על סכנה אנושה המאיימת עליו ונפרדת ממנו בקרירות, ומצביעה עליו אל הספינה שתיקח אותו לרומא. בייאוש מנסה ריצ'יו להתחנן למלכה לבטל את ההחלטה לעזוב. המלכה נחרצת.
היינריך, מורטון ולינדזי נודע על עזיבתו הממשמש ובאה של ריצ'יו והוקצו בחופזה להרוג אותו או לתת לו להפליג. ואז מופיע דגלאס ומדווח כי ריצ'יו כבר הפליג. דאגלס בייאוש, הוא מייחל לנקמה עקובה מדם, כבודו האבירי נפגע. לפתע הם פוגשים דף שמביא למלכה פתק מריקיו - הוא לא עזב ויהיה איתה בערב. הקושרים מורידים את הפתק.
מריה עסוקה ברקמה בחדרה. ריצ'יו, שהגיע, מסביר לה שהוא לא יכול היה לעזוב, כי יש לו דו קרב עם דאגלס בבוקר. הוא מודה שהוא לא זקוק לחיים בלי אהבתה. הוא מבקש ממרי לתת לו זר ורדים - הוא יישתל פרחים על המזבח ברומא ... הנרי, דגלאס ודינדסי נכנסים והורגים את ריצ'יו. המלכה מתעלפת. דגלאס נפגע מבושה ואימה - הוא פורש מרצונו לגלות. הנרי מודאג אם המלכה תשנא אותו. לינדזי לוקח את המלך משם, לוחש לו על הציד המתקרב. המלכה בוטוול מוזמנת על ידי המלכה. מרי מתעשתת, רואה את בוטוול ומתוודה על אהבתו אליו. המפלס מכריח אותה להודות שהיא רוצה את מותו של הנרי ונותן לה בקבוק רעל באומרו שזה כדור שינה. מרי נותנת למלך את "התרופה" הזו, אך הרעל שותה את הכף. עם זאת, שום דבר לא יכול לעצור את התככים הרצחניים - בוטוול מפוצץ את ביתו של המלך הנרי. מרחוק נשמעות זעקות ההמון הגוברות. המפלס עם המלכה מסתתר.